De ontdekking van een internationale groep wetenschappers, waaronder twee Brazilianen, kan bijdragen aan het minimaliseren van de vervuiling door het materiaal
Een internationale groep wetenschappers, waaraan twee Brazilianen van de Universiteit van Campinas (Unicamp) deelnemen, slaagde erin om de prestaties van PETase, een enzym dat zich kan voeden met polyethyleentereftalaat, PET-plastic, te verbeteren. Nadat PETase in 2016 was ontdekt in een nieuwe bacteriesoort, werkte de groep onderzoekers om de structuur van het enzym te achterhalen en de werking ervan te begrijpen. In dit proces creëerden ze per ongeluk een mutatie van het enzym dat een nog grotere affiniteit heeft met PET - dat wil zeggen, een groter potentieel om plastic af te breken.
Het werk heeft een enorm potentieel voor praktisch gebruik, aangezien naar schatting tussen de 4,8 en 12,7 miljoen ton plastic per jaar in de oceanen wordt gegooid - een aantal dat alleen maar groeit. Kunststoffen, die zich zelfs op de meest afgelegen stranden ter wereld ophopen, worden juist zo gebruikt vanwege hun weerstand tegen degradatie, wat het milieu het meest bedreigt. Als PET-fles wordt weggegooid, kan hij bijvoorbeeld 800 jaar in het milieu blijven - naast het groeiende en alarmerende probleem van microplastics.
- Begrijp de milieu-impact van plastic afval voor de voedselketen
- Waar komt het plastic vandaan dat de oceanen vervuilt?
Met dit alles is het gemakkelijk te begrijpen dat er grote interesse is gewekt door de ontdekking van een enzym dat polyethyleentereftalaat kan verteren. Dit enzym, PETase genaamd, heeft nu zijn vermogen om plastic af te breken vergroot. De nieuwigheid werd beschreven in een artikel gepubliceerd in de Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS).
Twee onderzoekers van het Chemistry Institute van de State University of Campinas (IQ-Unicamp) namen deel aan het onderzoek, in samenwerking met onderzoekers uit het Verenigd Koninkrijk (University of Portsmouth) en de Verenigde Staten (National Renewable Energy Laboratory). Dat zijn de postdoctorale fellow Rodrigo Leandro Silveira en zijn supervisor, de professor en pro-rector Research bij Unicamp Munir Salomão Skaf.
“Polyethyleentereftalaat wordt voornamelijk gebruikt bij de fabricage van drankflessen en wordt ook veel gebruikt bij de fabricage van kleding, tapijten en andere voorwerpen. In ons onderzoek hebben we de driedimensionale structuur gekarakteriseerd van het enzym dat dit plastic kan verteren, het te manipuleren, het zijn afbraakvermogen te verhogen, en aangetoond dat het ook actief is in polyethyleen-2,5-furaandicarboxylaat (PEF), een vervanger voor PET vervaardigd uit uit hernieuwbare grondstoffen, ”vertelde Silveira aan Agência FAPESP.
De belangstelling voor PETase ontstond in 2016, toen een groep Japanse onderzoekers, geleid door Shosuke Yoshida, een nieuwe bacteriesoort identificeerde, Ideonella sakaiensis , die polyethyleentereftalaat als koolstof- en energiebron kan gebruiken - met andere woorden, zich voeden met PET. Het is tot op heden het enige bekende organisme met deze capaciteit. Het groeit letterlijk op PET.
“Naast het identificeren van Ideonella sakaiensis , ontdekten de Japanners dat het twee enzymen produceerde die in het milieu worden uitgescheiden. Een van de uitgescheiden enzymen was PETase. Vanwege zijn kristalliniteitsgraad is PET een polymeer dat zeer moeilijk af te breken is. Technisch gesproken gebruiken we de term 'weerspannigheid' om de eigenschap te noemen dat bepaalde sterk verpakte polymeren bestand zijn tegen degradatie. PET is er een van. Maar PETase valt aan en breekt het af in kleine eenheden: mono (2-hydroxyethyl) tereftaalzuur (MHET). De MHET-eenheden worden vervolgens omgezet in tereftaalzuur [door een tweede enzym] en geabsorbeerd en gemetaboliseerd door de bacteriën, ”zei Silveira.
Alle bekende levende wezens gebruiken biomoleculen om te overleven. Alles behalve Ideonella sakaiensis, dat erin slaagt een synthetisch molecuul te gebruiken, vervaardigd door mensen. Dit betekent dat deze bacterie het resultaat is van een zeer recent evolutionair proces dat zich de afgelopen decennia heeft voorgedaan. Het slaagde erin zich aan te passen aan een polymeer dat werd ontwikkeld in het begin van de jaren 40 en pas werd gebruikt op industriële schaal in de jaren 70. Daarvoor is PETase het belangrijkste onderdeel.
“PETase doet het moeilijkste deel, namelijk de kristallijne structuur breken en PET depolymeriseren in MHET. Het werk van het tweede enzym, dat MHET omzet in tereftaalzuur, is al veel eenvoudiger, aangezien het substraat wordt gevormd door monomeren waartoe het enzym gemakkelijk toegang heeft omdat ze in het reactiemedium zijn gedispergeerd. Daarom concentreerden de onderzoeken zich op PETase ”, legt Silveira uit.
De volgende stap was om PETase in detail te bestuderen en dat was de bijdrage van het nieuwe onderzoek. “Onze focus was om erachter te komen wat PETase de mogelijkheid gaf om iets te doen dat andere enzymen niet erg efficiënt konden doen. Hiervoor was de eerste stap om de driedimensionale structuur van dit eiwit te verkrijgen ”, zei hij.
“Om de driedimensionale structuur te verkrijgen, moeten we de x-, y- en z-coördinaten ontdekken van elk van de duizenden atomen waaruit het macromolecuul bestaat. Onze Britse collega's hebben dit werk gedaan met behulp van een bekende en gebruikte techniek, genaamd röntgendiffractie ”, legt hij uit.
Gemodificeerd enzym bindt beter aan het polymeer
Toen de driedimensionale structuur eenmaal was verkregen, begonnen de onderzoekers PETase te vergelijken met verwante eiwitten. De meest vergelijkbare is een cutinase van de bacterie Thermobifida fusca, die cutine afbreekt, een soort natuurlijke vernis die de bladeren van planten bedekt. Bepaalde pathogene micro-organismen gebruiken cutinasen om de cutinebarrière te doorbreken en de in de bladeren aanwezige voedingsstoffen toe te passen.
Afbeelding: PETase-structuur, in blauw, met een PET-ketting (in geel) verbonden met zijn actieve plaats, waar hij zal worden afgebroken. Persbericht / Rodrigo Leandro Silveira.
“We ontdekten dat PETase in het gebied van het enzym waar chemische reacties plaatsvinden, de zogenaamde 'actieve site', enkele verschillen vertoonde met betrekking tot cutinase. Het heeft een meer open actieve site. Door computersimulaties - en dit was het deel waar ik het meest aan heb bijgedragen - konden we de moleculaire bewegingen van het enzym bestuderen. Terwijl de kristallografische structuur, verkregen door röntgendiffractie, statische informatie oplevert, maken de simulaties het mogelijk om over dynamische informatie te beschikken en om de specifieke rol van elk aminozuur in het afbraakproces van PET te ontdekken ”, legt de onderzoeker van IQ-Unicamp uit.
De fysica van de bewegingen van het molecuul is het resultaat van de elektrostatische aantrekkingskracht en afstoting van de enorme set atomen en de temperatuur. Computersimulaties lieten ons toe om beter te begrijpen hoe PETase bindt aan en interactie heeft met PET.
“We ontdekten dat PETase en cutinase twee verschillende aminozuren hebben op de actieve site. Door middel van moleculaire biologische procedures produceerden we vervolgens mutaties in PETase, met als doel het om te zetten in cutinase ”, zei Silveira.
“Als we dat zouden kunnen doen, zouden we laten zien waarom PETase PETase is, dat wil zeggen, we zouden weten wat de componenten zijn die het de bijzondere eigenschap geven om PET af te breken. Maar tot onze verbazing produceren we een nog actievere PETase als we de eigenaardige activiteit van PETase proberen te onderdrukken, dat wil zeggen, als we PETase in cutinase proberen te transformeren. We probeerden de activiteit te verminderen en in plaats daarvan verhoogden we deze ”, zei hij.
Dit vereiste verdere computationele studies om te begrijpen waarom het mutante PETase beter was dan het originele PETase. Met modellering en simulaties was het mogelijk om op te merken dat de veranderingen die in PETase worden geproduceerd, de koppeling van het enzym aan het substraat bevorderen.
Het gemodificeerde enzym bindt zich beter aan het polymeer. Deze koppeling is afhankelijk van geometrische factoren, dat wil zeggen, de pasvorm van het type "sleutel en slot" tussen de twee moleculen. Maar ook van thermodynamische factoren, dat wil zeggen van de interacties tussen de verschillende componenten van het enzym en het polymeer. De elegante manier om dit te omschrijven is door te zeggen dat het gemodificeerde PETase "grotere affiniteit" heeft voor het substraat.
In termen van een toekomstige praktische toepassing, om een ingrediënt te verkrijgen waarmee tonnen plastic afval kunnen worden afgebroken, was de studie een enorm succes. Maar de vraag wat PETase tot PETase maakt, blijft onbeantwoord.
“Cutinase heeft aminozuren a en b. PETase heeft de aminozuren x en y. We stellen ons voor dat door x en y te ruilen voor a en b, we PETase in een cutinase zouden kunnen transformeren. In plaats daarvan produceren we een verbeterde PETase. Met andere woorden, de twee aminozuren zijn niet de verklaring voor het differentiële gedrag van de twee enzymen. Het is iets anders, ”zei Silveira.
Lopende ontwikkelingen
Cutinase is een oud enzym, terwijl PETase een modern enzym is, het resultaat van de evolutionaire druk waardoor Ideonella sakaiensis zich kon aanpassen aan een medium dat alleen of voornamelijk polyethyleentereftalaat bevat als een bron van koolstof en energie.
Onder de vele bacteriën die dit polymeer niet konden gebruiken, genereerde een mutatie een soort die dat wel wist. Deze bacterie begon zich veel meer te vermenigvuldigen en te groeien dan de anderen omdat hij genoeg voedsel had. Daarmee ontwikkelde het zich. Dit is tenminste de verklaring die de standaard evolutietheorie biedt.
“Het feit dat we door een kleine verandering een beter enzym hebben gekregen, suggereert sterk dat deze evolutie nog niet is voltooid. Er zijn nog steeds nieuwe evolutionaire mogelijkheden die moeten worden begrepen en onderzocht om nog efficiëntere enzymen te verkrijgen. Verbeterde PETase is niet het einde van de weg. Het is nog maar het begin, ”zei Silveira.
Met het oog op de toepassing is de volgende stap de overgang van laboratorium- naar industriële schaal. Hiervoor zijn verdere studies op het gebied van reactortechniek, procesoptimalisatie en kostenreductie nodig.
